Sulle membrane per Western Blot

Quando si parla di Western Blotting,in pochi si rendono conto che la membrana è uno degli elementi più importanti. Solitamente ci si concentra sugli anticorpi, sulla preparazione del campione, sulla sua conservazione, sul tipo di gel da utilizzare ma la membrana viene solitamente bistrattata come se non avesse una grande importanza. In molti pensano che alla fin fine siano tutte uguali e che per la maggior parte delle applicazioni non ci sia poi questa grande differenza. Non è così.
Potete avere a disposizione i migliori anticorpi possibili ma se avete una membrana non adatta oppure una membrana che non sapete come utilizzare, il risultato del vostro esperimento non soddisferà le aspettative.
I due tipi di membrane principalmente utilizzati sono quelle in nitrocellulosa e quelle in polivinilidenfluoruro (PVDF).

Nitrocellulosa

 

Sono state tra i primi tipi di membrane utilizzate per il Western blotting e sono tutt’oggi molto popolari. Sono capaci di legare circa 80-100μg/cm2 di proteine tramite interazioni idrofobiche e generalmente danno un segnale di background molto basso in chemiluminescenza grazie ad una scarsa possibilità di legami aspecifici con gli anticorpi utilizzati. 

L’unico caso in cui l’uso della nitrocellulosa è fortemente sconsigliato è quello in cui vengano utilizzati anticorpi anti-chicken.

Si tratta di membrane idrofile, adatte quindi a blottaggi di tipo “wet” o “semi-dry” e possono essere equilibrate direttamente nel transfer buffer. Non sono tuttavia particolarmente resistenti e questo, sfortunatamente, le rende poco resistenti a procedure di stripping e riutilizzo. Oltre a ciò, è necessario l’utilizzo di transfer buffer contenenti metanolo che, nel caso in cui si sia interessati a proteine a proteine molto pesanti, può essere un notevole svantaggio. Esso infatti riducendo le dimensioni dei pori del gel, può ostacolare il trasferimento delle proteine a più alto peso molecolare.

Al contrario di quanto detto per la rivelazione in chemiluminescenza, le membrane in nitrocellulsa non sono assolutamente adatte nel caso in cui si utilizzino anticorpi fluorescenti in quanto si ha un forte rumore di background.

Ultimo ma non meno importante punto, costituisce l’opzione più economica.

Nitrocellulosa supportata

Si tratta di menbrane in cui la nitrocellulosa è stata depositata su un supporto inerte in poliestere.
La differenza con le normali membrane in nitrocellulosa è che sono molto meno fragilie più resistenti a ripetuta manipolazione. Resta però il problema relativo alla perdita di proteine in caso di stripping.

Polivinilidenfluoruro (PVDF)

Sono capaci di legare 170-200μg/cm2 di proteine tramite interazioni idrofobiche e dipolo. Grazie alla loro capacità di legare una maggior quantità di proteine, sono caratterizzate da una maggior sensibilità. Questo aspetto tuttavia si traduce anche in una maggior possibilità di ottenere legami aspecifici con gli anticporpi utilizzati che si traduce in un maggior rumore di background.
Sono molto resistenti e possono agilmente sostenere multipli step di strippaggio. Lo strippaggio inoltre, a differenza di quanto detto per la nitrocellulosa, non determina una perdita significativa della proteina legata.
Essendo un materiale idrofobico, queste membrane richiedono un passaggio in metanolo al 100% prima di essere equilibrate nel transfer buffer. Tuttavia è possibile evitare l’utilizzo di metanolo nel buffer di blottaggio.
Nel caso si utilizzino anticorpi fluorescenti, il PVDF costituisce sicuramente la scelta migliore in quanto sono dispinibili membrane appositamente concepite in grado di offrire in bassissimo rumore di background.
Nonostante negli ultimi tempi il PVDF la faccia da padrone, va comunque considerato che è l’opzione più costosa.

E i pori?

Indipendentemente dal fatto che scegliate la nitrocellulosa o il PVDF, avrete a disposizione solitamente due diverse porosità tra cui scegliere: 0,45μm o 0,2μm.
Le membrane da 0,45μm sono quelle più diffuse in quanto indicate per proteine con peso molecolare superiore ai 20kDa.
Le membrane da 0,2μm sono invece consigliate nel caso in cui:

• La proteina di interesse abbia un peso inferiore o vicino ai 20kDa
• La proteina di interesse sia molto poco espressa

Riassumendo: